大鼠钙非依赖性磷脂酶A2(iPLA2)ELISA试剂盒

检测原理 :

本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ ELISA）。在预包被 大鼠钙非依赖性磷脂酶A2(iPLA2)止抗体（固相抗体）的微孔酶标板中，加入 大鼠钙非依赖性磷脂酶A2(iPLA2) 校准品和待测样本，再加入另一株 HRP标记的抗 大鼠钙非依赖性磷脂酶A2(iPLA2) （酶标抗体），经过温育与充分洗涤，去除未结合的组分，在微孔板固相表面形成固相抗体 -抗原-酶标抗体的夹心复合物。加底物 A和 B，底物在 HRP催化下，产生蓝色产物，在终止液（2M 硫酸）作用下，最终转化为黄色，在酶标仪 450nm波长上测定吸光度（OD值），吸光度（OD值）与待测样品中 大鼠钙非依赖性磷脂酶A2(iPLA2)的浓度正相关。拟合校准品曲线，可以计算出样本中 大鼠(iPLA2)的浓度。

所需器材和试剂

1、 酶标仪 (波长 450nm 滤光片)

2、37°C 恒温箱(不推荐使用细胞用 CO2 培养箱)

3、 自动洗板机或多道移液器 /5ml 滴管(手工洗板用)

4、 无菌的 EP 管及一次性吸头

5、 精密的单道 (0.5-10μL, 5-50μL, 20-200μL, 200-1000μL)和多通道移液器(移液器使用前需校准)。

6、吸水纸及加样槽

7、去离子水或蒸馏水

试剂盒组成：

标本收集 :

1、收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。

2、 血浆抗凝剂推荐使用 EDTA 。避免使用溶血，高血脂标本。

3、标本应清澈透明，悬浮物应离心去除。

4、 标本收集后若不及时检测，请按一次使用量分装，冻存于 -20 ℃ , -70 ℃电冰箱内，避免反复冻融，3-6月内检测。

5、 如果您的样本中检测物浓度高于标准品最高值，请根据实际情况， 做适当倍数稀释 (建议做预实验，以确定稀释倍数)。

储存条件：

样品采集及保存：

1、 血清全血样本室温放置 2小时或 2-8°C 过夜。1000×g 离心20分钟，取上清。可立即检测，或按一次使用量分装冻存于-20°C 或-80°C。

2、 血浆抗凝剂推荐使用 EDTA-Na2/K2，样品采集后30分钟内于2-8°C，1000×g 离心15分钟，取上清。可立即检测，或按一次使用量分装冻存于-20°C 或-80°C。其他抗凝剂的使用及选择请查看样品制备指南。

3、组织样本组织样本一般制成组织匀浆，处理方法如下：
3.1、 将目标组织置于冰上，用预冷的 PBS缓冲液(0.01M，pH=7.4)洗涤去除残留的血液，称重后备用。

3.2、 在冰上用裂解液研磨组织匀浆。加入裂解液的体积取决于组织的重量，一般情况每 1g 组织碎片使用9ml裂解液。另外建议在裂解液中加入蛋白酶抑制剂，如 1mM PMSF。

3.3、 可再利用超声破碎或反复冻融进一步处理 (超声破碎过程中，需冰浴降温；反复冻融法可重复2次)。

3.4、 将制备好的匀浆液于 5000×g 离心 5 分钟，留取上清即可检测。或按一次使用量分装冻存于-20°C 或-80°C。

3.5、 根据实验需要，组织匀浆样本可先测定总蛋白浓度 ,以便于数据分析，推荐 BCA 法。一般调整总蛋白浓度至 1-3mg/ml 用于 ELISA 检测。某些组织样本，如肝脏，肾脏，胰腺因含有较高浓度的内源性过氧物酶, 在样品浓度较高的情况下会和显色底物反应，出现假阳性。可尝试使用 1%H2O2 灭活 15min 再检测。

注意： 裂解液常用 PBS 缓冲液，或使用中等强度 RIPA 裂解液。使用 时，PH 值需调整为PH7.3，避免使用含 NP-40，Triton X-100 和 DTT 的组分，会严重抑制试剂盒工作。推荐使用50mM Tris+0.9%NaCL+0.1% SDS,PH 7.3，可自行配制或联系我们购买。

4、 细胞培养上清收集上清液， 2-8°C，2500rpm 离心 5min，收集澄清的细胞培养上清。立即用于检测，或按一次使用量分装于-80°C 冻存备用。

5、细胞裂解液

5.1、 悬浮细胞的收集及裂解： 2-8°C，2500rpm 离心 5min，收集细胞。再加入预冷的 PBS 轻轻混匀清洗，2-8°C，2500rpm 离心 5min，收集细胞。加入 0.5-1ml 细胞裂解液及适量蛋白酶抑制剂(如 PMSF，工作浓度 1mmol/L)，置于冰上，裂解 30min-1h , 或者配合超声波破碎。

5.2、 贴壁细胞的收集及裂解：吸走上清液，加入预冷的 PBS 洗三次。加入 0.5-1ml 细胞裂解液及适量蛋白酶抑制剂(如PMSF，工作浓度 1mmol/L)，用细胞刮轻轻刮下贴壁细胞。细胞悬液转入离心管中，置于冰上，裂解 30min-1h，或者配合超声波破碎。

5.3、 细胞裂解过程中可用枪头吹打或间断摇动离心管，使蛋白充分裂解 , 出现黏糊状是 DNA，可以使用超声波破碎DNA。(或用超声波 3-5mm 探头，功率 150-300W, 冰上超声处理样品，工作 1-2 秒，停止 30 秒， 3~5 个循环。)

5.4、 裂解或超声破碎完成， 2-8°C，10000rpm 离心 10min，上清移入 EP 管中，立即用于检测，或按一次使用量分装于-80°C 冻存备用。

注意：注意事项同组织样本。

6、 其他生物样本 2-8°C，1000×g 离心样品 20 分钟。收集上清液立即用于检测，或按 一次使用量分装于-80°C 冻存备用。

操作步骤：

步骤 1： 向孔中加入 100ul 标准品或待测样品，贴上覆膜， 37°C 静置孵育 90 分钟。

洗板： 洗板 2 次。不浸泡。

步骤 2： 加入 100ul 生物素-抗体工作液，贴上覆膜， 37°C 静置孵育 60 分钟。

洗板： 洗板 3 次。每次浸泡 1 分钟。

步骤 3： 加入 100ul HRP-链霉亲和素(SABC)工作液，贴上覆膜，37°C 静置孵育 30 分钟。

洗板： 洗板 5 次。每次浸泡 1 分钟。

步骤 4： 添加 90ul TMB 显色底物。贴上覆膜， 37°C 静置孵育 10-20 分钟(请使用 TMB 显色精准控制方法)。

步骤 5： 添加 50ul 反应终止液。立即在 450nm 处读取 OD450 值并计算。

注意事项：

1、使用不同的试剂盒时，需先做好标记，防止组分混用，导致实验失败。

2、 试剂盒开启后，酶标板和标准品的保存条件请参考组件保存条件表格 (受潮后活性会下降)。如发生使用或保存不当 导致组件缺损，可申请购买配套组件 (如 E002 冻干标准品)。

3、请使用无菌一次性吸头吸取试剂，使用后，须旋紧试剂瓶盖，以防止微生物污染和蒸发。

4、手工洗板时，加洗液的吸头或滴管，切勿接触酶标板孔。不充分的洗涤或污染容易造成假阳性和高背景。

5、检测过程中，请提前准备好下一步实验所需试剂，洗板后及时将试剂加入板孔，防止板孔干燥，导致检测失效。

6、在未经确认的情况下，请勿将其他批次试剂盒的试剂或其他来源的试剂用于本试剂盒。

7、请勿重复使用一次性吸头，以免造成交叉污染。

8、加样完成，贴覆膜以防孵育过程样品的蒸发，在推荐温度下完成孵育过程。

9、试验中请穿实验服、戴口罩、手套等，做好防护工作。特别是检测血液或者其他体液样品时，请按生物试验室安全防护条例执行。

总结：感谢您选用本公司ELISA系列产品。本产品可检测血清、血浆、细胞培养上清液、灌洗液、尿液、羊水、腹水、脑脊液、胸腔积液、组织匀浆液等多种类型样本大鼠(iPLA2)浓度，具体适用样本请咨询本商铺。