检测原理
:
本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（
ELISA）。在预包被
大鼠成纤维细胞生长因子6(FGF6)止抗体（固相抗体）的微孔酶标板中，加入
大鼠成纤维细胞生长因子6(FGF6)
校准品和待测样本，再加入另一株
HRP标记的抗
大鼠成纤维细胞生长因子6(FGF6)
（酶标抗体），经过温育与充分洗涤，去除未结合的组分，在微孔板固相表面形成固相抗体
-抗原-酶标抗体的夹心复合物。加底物 A和 B，底物在 HRP催化下，产生蓝色产物，在终止液（2M 硫酸）作用下，最终转化为黄色，在酶标仪
450nm波长上测定吸光度（OD值），吸光度（OD值）与待测样品中
大鼠成纤维细胞生长因子6(FGF6)的浓度正相关。拟合校准品曲线，可以计算出样本中
大鼠(FGF6)的浓度。
所需器材和试剂
1、
酶标仪
(波长 450nm 滤光片)
2、37°C 恒温箱(不推荐使用细胞用 CO2 培养箱)
3、
自动洗板机或多道移液器
/5ml 滴管(手工洗板用)
4、
无菌的
EP 管及一次性吸头
5、
精密的单道
(0.5-10μL, 5-50μL, 20-200μL, 200-1000μL)和多通道移液器(移液器使用前需校准)。
6、吸水纸及加样槽
7、去离子水或蒸馏水
试剂盒组成：
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名称
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48Ｔ
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96Ｔ
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抗体预包被酶标板
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8×6
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8×12
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冻干标准品
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0.5 ng/支×2支
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0.5 ng/支×3支
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标准品
&标本通用稀释液
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12ml×1瓶
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20ml×1瓶
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浓缩生物素化抗体
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1支(规格见标签）
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1支(规格见标签）
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生物素化抗体稀释液
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10ml×1瓶
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16ml×1瓶
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浓缩酶结合物
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1支(规格见标签）
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1支(规格见标签）
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酶结合物稀释液
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10ml×1瓶
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16ml×1瓶
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浓缩洗涤液
20×
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25ml×1瓶
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50ml×1瓶
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显色底物(TMB)
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6ml×1瓶
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12ml×1瓶
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反应终止液具腐蚀性
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6ml×1瓶
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12ml×1瓶
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封板胶纸
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3张
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6张
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产品说明书
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1份
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1份
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标本收集
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1、收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。
2、
血浆抗凝剂推荐使用
EDTA 。避免使用溶血，高血脂标本。
3、标本应清澈透明，悬浮物应离心去除。
4、
标本收集后若不及时检测，请按一次使用量分装，冻存于
-20 ℃ , -70 ℃电冰箱内，避免反复冻融，3-6月内检测。
5、
如果您的样本中检测物浓度高于标准品最高值，请根据实际情况，
做适当倍数稀释
(建议做预实验，以确定稀释倍数)。
储存条件：
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未开封完整试剂盒
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4℃保存，请在保质期内使用
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已封完整试剂盒
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抗体包被板条
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未用完的板条放回带拉链铝箔袋，封好口
4℃条件下可储存1个月左右
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标准品
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冻干粉
-20℃可储存6 个月左右，
稀释后的标准品使用后请丢弃
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浓缩生物素化抗体
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浓缩液
4℃可储存1个月左右，
释后即用即弃
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浓缩酶结合物(避光)
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标准品＆标本通用稀释液
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4℃条件下，可储存1 个月左右
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生物素化抗体稀释液
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酶结合物稀释液
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显色底物(避光)
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反应终止液
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浓缩洗涤液
20×
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样品采集及保存：
1、
血清全血样本室温放置
2小时或 2-8°C 过夜。1000×g 离心20分钟，取上清。可立即检测，或按一次使用量分装冻存于-20°C 或-80°C。
2、
血浆抗凝剂推荐使用
EDTA-Na2/K2，样品采集后30分钟内于2-8°C，1000×g 离心15分钟，取上清。可立即检测，或按一次使用量分装冻存于-20°C
或-80°C。其他抗凝剂的使用及选择请查看样品制备指南。
3、组织样本组织样本一般制成组织匀浆，处理方法如下：
3.1、
将目标组织置于冰上，用预冷的
PBS缓冲液(0.01M，pH=7.4)洗涤去除残留的血液，称重后备用。
3.2、
在冰上用裂解液研磨组织匀浆。加入裂解液的体积取决于组织的重量，一般情况每
1g 组织碎片使用9ml裂解液。另外建议在裂解液中加入蛋白酶抑制剂，如 1mM PMSF。
3.3、
可再利用超声破碎或反复冻融进一步处理
(超声破碎过程中，需冰浴降温；反复冻融法可重复2次)。
3.4、
将制备好的匀浆液于
5000×g 离心 5 分钟，留取上清即可检测。或按一次使用量分装冻存于-20°C 或-80°C。
3.5、
根据实验需要，组织匀浆样本可先测定总蛋白浓度
,以便于数据分析，推荐 BCA 法。一般调整总蛋白浓度至 1-3mg/ml 用于 ELISA 检测。某些组织样本，如肝脏，肾脏，胰腺因含有较高浓度的内源性过氧物酶,
在样品浓度较高的情况下会和显色底物反应，出现假阳性。可尝试使用 1%H2O2 灭活 15min 再检测。
注意：
裂解液常用
PBS 缓冲液，或使用中等强度 RIPA 裂解液。使用 时，PH 值需调整为PH7.3，避免使用含 NP-40，Triton X-100 和 DTT
的组分，会严重抑制试剂盒工作。推荐使用50mM Tris+0.9%NaCL+0.1% SDS,PH 7.3，可自行配制或联系我们购买。
4、
细胞培养上清收集上清液，
2-8°C，2500rpm 离心 5min，收集澄清的细胞培养上清。立即用于检测，或按一次使用量分装于-80°C 冻存备用。
5、细胞裂解液
5.1、
悬浮细胞的收集及裂解：
2-8°C，2500rpm 离心 5min，收集细胞。再加入预冷的 PBS 轻轻混匀清洗，2-8°C，2500rpm 离心 5min，收集细胞。加入 0.5-1ml
细胞裂解液及适量蛋白酶抑制剂(如 PMSF，工作浓度 1mmol/L)，置于冰上，裂解 30min-1h , 或者配合超声波破碎。
5.2、
贴壁细胞的收集及裂解：吸走上清液，加入预冷的
PBS 洗三次。加入 0.5-1ml 细胞裂解液及适量蛋白酶抑制剂(如PMSF，工作浓度 1mmol/L)，用细胞刮轻轻刮下贴壁细胞。细胞悬液转入离心管中，置于冰上，裂解
30min-1h，或者配合超声波破碎。
5.3、
细胞裂解过程中可用枪头吹打或间断摇动离心管，使蛋白充分裂解
, 出现黏糊状是 DNA，可以使用超声波破碎DNA。(或用超声波 3-5mm 探头，功率 150-300W, 冰上超声处理样品，工作 1-2 秒，停止 30 秒， 3~5 个循环。)
5.4、
裂解或超声破碎完成，
2-8°C，10000rpm 离心 10min，上清移入 EP 管中，立即用于检测，或按一次使用量分装于-80°C 冻存备用。
注意：注意事项同组织样本。
6、
其他生物样本
2-8°C，1000×g 离心样品 20 分钟。收集上清液立即用于检测，或按 一次使用量分装于-80°C 冻存备用。
操作步骤：
步骤
1：
向孔中加入
100ul 标准品或待测样品，贴上覆膜， 37°C 静置孵育 90 分钟。
洗板：
洗板
2 次。不浸泡。
步骤
2：
加入
100ul 生物素-抗体工作液，贴上覆膜， 37°C 静置孵育 60 分钟。
洗板：
洗板
3 次。每次浸泡 1 分钟。
步骤
3：
加入
100ul HRP-链霉亲和素(SABC)工作液，贴上覆膜，37°C 静置孵育 30 分钟。
洗板：
洗板
5 次。每次浸泡 1 分钟。
步骤
4：
添加
90ul TMB 显色底物。贴上覆膜， 37°C 静置孵育 10-20 分钟(请使用 TMB 显色精准控制方法)。
步骤
5：
添加
50ul 反应终止液。立即在 450nm 处读取 OD450 值并计算。
注意事项：
1、使用不同的试剂盒时，需先做好标记，防止组分混用，导致实验失败。
2、
试剂盒开启后，酶标板和标准品的保存条件请参考组件保存条件表格
(受潮后活性会下降)。如发生使用或保存不当
导致组件缺损，可申请购买配套组件
(如 E002 冻干标准品)。
3、请使用无菌一次性吸头吸取试剂，使用后，须旋紧试剂瓶盖，以防止微生物污染和蒸发。
4、手工洗板时，加洗液的吸头或滴管，切勿接触酶标板孔。不充分的洗涤或污染容易造成假阳性和高背景。
5、检测过程中，请提前准备好下一步实验所需试剂，洗板后及时将试剂加入板孔，防止板孔干燥，导致检测失效。
6、在未经确认的情况下，请勿将其他批次试剂盒的试剂或其他来源的试剂用于本试剂盒。
7、请勿重复使用一次性吸头，以免造成交叉污染。
8、加样完成，贴覆膜以防孵育过程样品的蒸发，在推荐温度下完成孵育过程。
9、试验中请穿实验服、戴口罩、手套等，做好防护工作。特别是检测血液或者其他体液样品时，请按生物试验室安全防护条例执行。
总结：感谢您选用本公司ELISA系列产品。本产品可检测血清、血浆、细胞培养上清液、灌洗液、尿液、羊水、腹水、脑脊液、胸腔积液、组织匀浆液等多种类型样本大鼠(FGF6)浓度，具体适用样本请咨询本商铺。
