我们经常用ELISA检测试剂盒来做试验，那么ELISA检测试剂盒的实验步骤有哪些呢？

1、试剂准备：根据选择的试剂盒准备好相关试剂。

2、样品准备：血清、血浆、尿液、胸腹水、脑脊液、细胞培养上清、组织标本等。

3、试剂配置

4、抗体包被：Coating Buffer: 稀释成Coating Buffer （1×），根据产品说明书稀释抗体，每孔加入100ul预稀释的抗体，4°C过夜孵育（16-18h）。

5、使用前，将所有试剂充分混匀，避免产生泡沫。

6、根据实验孔（空白和标准品）数量，确定所需的板条数目。样品（含标准品）和空白都应做复孔。

7、加样：100 μL/well 加入稀释后的 Cytokine standard 至标准品孔，100 μL/well 加入样品至样品孔，100 μL/well 加 Dilution buffer R (1×)入空白对照孔。

8、加检测抗体：根据产品说明书加入 Biotinylated antibody 。混匀后盖上封板膜，室温孵育。

9、洗板：扣去孔内液体，300 μL/well 加入 1×washing buffer；停留 1 分钟后弃去孔内液体。重复 3 次，每一次在滤纸上扣干。

10、加酶：根据产品说明书加入稀释好的酶，孵育。

11、洗板：重复步骤 5 。

12、显色：100 μL/well 加入 TMB，室温（18-25℃）避光孵育5-30分钟之间，根据孔内颜色的深浅（深蓝色）来判定终止反应。通常显色 10-20 分钟可以达到很好的效果。

13、终止反应：迅速 100 μL/well 加入 Stop solution 终止反应。

14、读板：终止后 10 分钟内，用检测波长（measurement wavelength）450 nm 读值。推荐用双波长即检测波长（measurement wavelength）450 nm 、参考波长或校正波长（reference wavelength ）610-630 nm 同时读板，测量结果会更准确。